mTOR kinase inhibitor CC-223 suppresses human breast cancer cell viability

AIM: To investigate the inhibitory effect of CC-223, an inhibitor of mammalian target of rapamycin (mTOR) kinase, on the viability of human breast cancer cells and its mechanism. METHODS: The inhibitory effect of CC-223 on the viability of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells was measured by CCK-8 assay. The cell cycle distribution of breast cancer cells was examined by flow cytometry. The expression of cell cycle-related proteins and oncoproteins c-Myc and survivin was analyzed by Western blot. RESULTS: CC-223 significantly inhibited the viability of both MCF-7 and MDA-MB-231 cells (P<0.05). CC-223 induced cell cycle arrest in both G₁ phase and G₂/M phase in the MCF-7 cells (P<0.05). However, low concentration of CC-223 treatment resulted in the accumulation of MDA-MB-231 cell cycle in the G₂/M phase, and the cell number in G₁ phase was unaffected. Treatment with CC-223 for 24 h clearly inhibited the protein levels of cyclin B1, cyclin D1 and phosphorylated cell division cycle protein 2 in the breast cancer cells (P<0.05). CC-223 suppressed the expression of c-Myc and survivin in both MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells (P<0.05). CONCLUSION: CC-223 inhibits cell viability by blocking cell cycle progression and down-regulating expression of c-Myc and survivin in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells.     

马链球菌兽疫亚种烯醇化酶对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响

旨在研究马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）烯醇化酶（enolase，Eno）对小鼠肺泡巨噬细胞（RAW264.7）吞噬能力的影响。通过构建原核表达质粒获得重组烯醇化酶（rEno），采用台盼蓝活细胞计数法，判定在不同处理浓度和时间下rEno蛋白对RAW264.7细胞的细胞毒性。将rEno蛋白与RAW264.7细胞共孵育后，用SEZ作用于细胞并检测细胞吞菌数量，判断RAW264.7细胞对SEZ的吞噬活性。进一步通过活细胞稳定同位素标记技术（SILAC）和蛋白质谱分析技术（LC-MS/MS），筛选到RAW264.7细胞中可能与SEZ Eno存在相互作用的候选蛋白。结果发现，10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理对RAW264.7细胞有明显的细胞毒性，且10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理RAW264.7细胞2和4 h可显著抑制其对SEZ的吞噬作用（P<0.01、P<0.05）。初步筛选到RAW264.7细胞中动力蛋白激活蛋白亚单位蛋白（dynactin subunit protein 2，Dctn）、整合素α-M蛋白（integrin alpha-M）等17种可能与Eno发生互作的蛋白。本研究获得了rEno重组表达蛋白，发现rEno可减少RAW264.7细胞对SEZ的吞噬，互作蛋白的初步筛选也为进一步揭示Eno在SEZ抗吞噬中的作用机制奠定了基础。     

与鸭C4结合蛋白互作的鸭疫里默菌外膜蛋白的筛选及鉴定

旨在筛选并鉴定与鸭C4结合蛋白（C4b-binding protein，C4BP）互作的鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，R.anatipestifer）外膜蛋白。本研究将保存的R.anatipestifer复苏培养，提取外膜蛋白，以鸭C4BPα作为诱饵蛋白进行His pull-down及LC-MS/MS蛋白质谱鉴定，筛选与鸭C4BP可能发生互作的候选外膜蛋白；将各候选蛋白进行克隆、原核表达，免疫小鼠制备多克隆抗体，利用Far-western blot验证与鸭C4BP发生相互作用的R.anatipestifer外膜蛋白；针对候选蛋白及C4BPα各功能结构域进行克隆及原核表达，利用Far-western blot鉴定候选蛋白及与C4BP的相互作用位点；利用ELISA对补体因子C3b、C4b及C4BP在R.anatipestifer表面沉积情况进行测定，验证候选蛋白的功能。结果显示，经His pull-down及LC-MS/MS蛋白质谱分析，共筛选出3个与鸭C4BP发生相互作用的R.anatipestifer外膜蛋白，即ECE-1、SODs和Omp62；成功获得3个外膜蛋白多克隆抗体，ELISA检测3种多克隆抗体效价均超过1∶6 400，Western blot检测3种多克隆抗体可以与重组蛋白发生特异性反应；Far-western blot结果显示，仅ECE-1能够与C4BP发生相互作用，并且只有ECE-1全长能与鸭C4BP相互作用，而鸭C4BP与ECE-1的相互作用区域位于C4BPα的SCR 2和SCR 3；当健康鸭血清稀释度为3.125%时，ECE-1抗体能够显著促进补体因子C3b、C4b在R.anatipestifer表面的沉积作用（P<0.05），当健康鸭血清稀释度为6.25%时，ECE-1抗体能够显著抑制C4BP在R.anatipestifer表面的沉积作用（P<0.05）。本研究成功筛选并鉴定出1个与C4BP互作的R.anatipestifer外膜蛋白ECE-1，为进一步阐明R.anatipestifer免疫逃逸机制奠定了基础。     

基于S基因序列分析新型猪流行性腹泻病毒的遗传演化

最近，笔者实验室在青藏高原地区发现两种新亚型藏猪源猪流行性腹泻病毒（PEDV），为进一步调查新型PEDV是否在四川腹泻猪群中存在或流行，对实验室2018-2019年保存的116份猪腹泻粪便或肠组织样本进行PEDV的检测及其纤突蛋白基因（spike）分子特征研究。结果表明：腹泻样本的PEDV检出率为42.2%（49/116，95% CI=33.1%~51.8%），并获得了13条完整的S基因序列，全长为4 149~4 170 bp，序列相似性为94.2%~99.9%，其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019的S基因与藏猪源新G1亚群PEDV的序列相似性高达97.0%~98.6%。遗传演化研究结果表明13株PEDV S基因划分为G1和G2大群，其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019位于藏猪源新G1亚群；SWUN-19-CH-SCZY-2018、SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-1-CH-SCNJ-2019和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019位于G2亚群中一个独立的分支，且与藏猪源新G2亚群毒株有着较近的亲缘关系。为了进一步研究13株PEDV的演化过程，以贝叶斯进化分析软件包（BEAST）进行分歧时间估算，结果表明SWUN-H3-CH-SCYA-2019的分歧时间约为2012.3年，早于藏猪源新G1亚群其余毒株的最早分歧时间（2015.7年）；SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-19-CH-SCZY-2018和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019的分歧时间约为2014.2年，早于G2亚群的藏猪源毒株2014.7年，所有藏猪源PEDV的分歧时间均晚于四川毒株。本研究在四川地区首次发现了藏猪源PEDV，并且从毒株的分歧时间推断青藏高原的藏猪源PEDV来源于四川，为新型PEDV分子遗传进化的监测提供了依据。     

H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定

为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯化的M1目的蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771 bp的M1基因,成功构建p ET-SUMO-M1表达载体,表达的融合蛋白相对分子量为41 kD,主要以可溶形式表达,纯化后获得蛋白纯品,Western blot检测显示用M1蛋白(28 k D)免疫小鼠制备的多抗能与制备的蛋白纯品发生特异性反应,从而证明蛋白纯品为M1目的蛋白。试验制备出的M1蛋白纯品可为进一步制备通用型抗犬流感病毒抗体提供纯品抗原。     

大丽轮枝孢激活蛋白对小麦旗叶面积及其光合特性和籽粒产量的影响

为明确大丽轮枝孢激活蛋白（Verticillium Dahliae Asp-f2 Like，简称VDAL）对冬小麦旗叶面积、花后光合特性及籽粒产量的影响，于2017-2018和2018-2019年两个小麦生长季，以强筋冬小麦品种藁优2018为材料，在河北藁城设置大丽轮枝孢激活蛋白种子包衣，并在大田条件下设置春三叶（倒四叶）露尖（S3）、春四叶（倒三叶）露尖（S4）、春五叶（倒二叶）露尖（S5）、春六叶（旗叶）露尖（S6）以及孕穗期（SB）叶面喷施VDAL和全生育期不喷施VDAL（S0）6个处理，以不包衣且不喷施为对照（CK），分析了VDAL对小麦旗叶面积、花后光合特性和产量的影响。结果表明，S4和S5处理显著（P＜0.05）增加了旗叶的长或宽，从而增大了叶面积。S4、S5和S6处理可以维持旗叶花后较高水平的净光合速率。各喷施处理的籽粒产量均有不同程度的提高，与CK相比，两年间S4处理的籽粒产量均显著（P＜0.05）提高，2018-2019年，S5处理的穗粒数和籽粒产量也显著（P＜0.05）提高。综上，采用VDAL种子包衣，并于春生4~5叶龄喷施VDAL，可以增加旗叶面积和旗叶花后净光合速率，提高穗粒数和千粒重，从而达到增加产量的目的。     

色氨酰-tRNA合成酶基因WRS1调控水稻种子发育

【目的】氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases, aaRSs）与遗传信息传递密切相关,已发现植物中aaRSs家族蛋白在维持翻译功能之余,还参与配子发生与胚发育、质体的早期发育以及免疫信号的感知与病害防御等生物学过程。本研究利用水稻胚乳发育缺陷突变体,分析水稻色氨酰-tRNA合成酶（WRS1）在胚乳发育中的作用,证明WRS1基因编码一个影响水稻胚乳发育的关键因子。【方法】本研究通过甲烷磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate, EMS）诱变籼稻（Oryza sativa subsp. indica）品种N22,筛选到一个稳定遗传的水稻粉质胚乳突变体（wrs1）,图位克隆获得目标基因。对wrs1成熟种子进行形态学观察以及淀粉相关理化性质测定,利用细胞学切片分析wrs1发育中胚乳的结构,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和GUS活性染色分析基因表达模式,通过qRT-PCR比较野生型与突变体花后12 d胚乳中淀粉合成相关基因表达情况,免疫印迹检测野生型与突变体成熟种子中淀粉合成酶蛋白积累情况,使用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。【结果】 wrs1突变体幼苗表现出明显的发育滞后且逐渐蔫萎死亡,从杂合突变体（WRS1wrs1）中分离到的粉质籽粒呈现明显的腹部皱缩,粒厚、千粒重下降,同时总淀粉含量下降,糊化淀粉的峰值黏度和崩解值均低于野生型。wrs1突变体发育胚乳中复合淀粉颗粒变小,排列疏松。WRS1定位于第12染色体长臂约183 kb的区间内,测序发现编码色氨酰-tRNA合成酶（tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS）基因的第6外显子上发生单碱基替换,导致一个保守位置上的甲硫氨酸被替换。wrs1突变体中大部分淀粉合成相关基因表达量下调,且野生型与突变体间基因表达的变化与相应蛋白积累的差异存在不一致的趋势。wrs1突变体籽粒中蛋白质积累降低,而游离氨基酸含量显著升高。【结论】 WRS1编码色氨酰-tRNA合成酶,该基因突变后通过影响氨基酸稳态和蛋白质合成,造成淀粉合成相关基因异常表达从而影响淀粉的合成与积累,导致种子发育缺陷。     

狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排后在小鼠神经母细胞瘤细胞中的表型分析

【目的】探究狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排对基因转录和蛋白表达的影响,揭示病毒在小鼠神经母细胞瘤(NA)细胞中的表型变化与M基因重排的相关性。【方法】通过荧光定量PCR、Western blot以及病毒在NA细胞中的生长和扩散试验,对亲本毒株rHEP-Flury和M基因重排毒株M2、M4在NA细胞中的基因转录、表达、生长和扩散进行比较。【结果】狂犬病病毒结构基因的转录和表达主要受病毒基因组RNA合成的影响,但是在一个完整转录过程中单个结构基因的转录比例与其所在位置相关,M基因重排病毒的Leader RNA (LeRNA)和L mRNA的转录比例显著高于亲本毒株rHEP-Flury。M基因重排病毒在NA细胞中的生长和扩散都劣于亲本毒株rHEPFlury。【结论】狂犬病病毒亲本毒株rHEP-Flury具有狂犬病病毒原始的基因组顺序,在NA细胞中的生长和扩散都明显优于M基因重排病毒。结构基因在基因组中的位置主要决定其在一次转录过程中的转录比例,进而影响病毒在NA细胞中的生长和扩散。     

Effects of germination and kilning on the phenolic compounds and nutritional properties of quinoa (Chenopodium quinoa) and kiwicha (Amaranthus caudatus)

Quinoa (Chenopodium quinoa) and kiwicha (Amaranthus caudatus) are nutritious pseudocereals that originate from the Andean region. The aim of this research was to study the effect of germination and the subsequent kilning on the phenolic compounds and proximate composition in selected Peruvian varieties of quinoa (“Chullpi”) and kiwicha (“Oscar Blanco”). The germination process was carried out for 24, 48 and 72 h at 22 °C, and the kilning was performed with samples germinated for 72 h by drying the seeds at 90 °C for 5 min. Both processes increased the protein content of the samples. However, lipid content was reduced during germination. On the other hand, germination and kilning clearly increased the concentration of total phenolic compounds in both quinoa and kiwicha. Germination for 72 h either with or without kilning process resulted in a significant (p < 0.05) increase in the total content of phenolics compared to untreated materials, which was especially due to coumaric acid and a kaempferol tri-glycoside in quinoa and caffeoylquinic acid in kiwicha. Based on the results, germination and kilning may improve the nutritional quality of the Andean grains, encouraging the usage of the processed grains as ingredients in functional products for people with special gluten-free or vegetarian diets.